OctoPus: Experimental quantification of amino acid demand in Pseudomonas putida and its role in heterologous protein production

DNA Replikation, mRNA Transkription und Protein Translation, auch bekannt als das zentrale Dogma der Biologie, sind die molekularen Prozesse die den Fluss von genetischer Informationen in biologischen Systemen bestimmen. Diese Vorgänge sind essenziell für das Zellwachstum sowie das Überleben, wobei alle Zellen im Grunde über den gleichen Pool an Ressourcen verfügen, um dies zu ermöglichen. Die wichtigsten Bestandteile dieses Pools sind tRNAs, Nukleotide, Ribosomen und Aminosäuren.

Die Ressourcen in der Zelle sind jedoch limitiert, weshalb die Verteilung dieser zwischen verschiedenen zellulären Prozessen, im Englischen auch ‘resource allocation‘ genannt, die Funktion einer Zelle bestimmt. Wenn Bakterien einem Stress ausgesetzt sind, fließt ein Großteil der zellulären Ressourcen in Vorgänge relevant für das Überleben der Zelle ein. Dementsprechend werden Prozesse, die mit dem Wachstum verbunden sind, kurzzeitig stillgelegt. Ein weiteres Beispiel dieser Aufteilung von Ressourcen in Zellen ist die heterologe Proteinexpression, die oft in der Biotechnologie durchgeführt wird. Dieser, für die Wirtszelle fremde, Prozess entzieht Ressourcen aus dem erschöpflichen Pool der Zelle und folglich sind weniger Ressourcen für intrinsische Vorgänge wie Zellwachstum vorhanden. Dieses Phänomen, in der Wissenschaft bekannt als Stoffwechsellast (metabolic burden), erschwert die Anwendung der heterologen Proteinexpression in einem industriellen Maßstab. Der Schlüssel, um die Effekte der Stoffwechsellast zu verstehen und darauffolgend zu mildern, ist die Quantifizierung der Synthesekosten von verschiedenen zellulären Ressourcen.

Eine dieser Schlüsselkomponenten sind Aminosäuren. Eine Vielzahl an Untersuchungen wurde an der (Über-) Produktion von Aminosäuren in E. coli ausgeführt, wobei allerdings wenig über die Kosten der Synthese einzelner Aminosäuren ermittelt wurde. Das Ziel dieses Projektes ist darum, die Synthesekosten verschiedenere Aminosäuren in dem biotechnologisch relevanten gram-negativen Bakterium Pseudomonas putida zu quantifizieren. Der experimentelle Teil wird sich darauf fokussieren eine quantifizierbare Last für das Zellwachstum von P. putida darzustellen, indem bestimmte Aminosäuren aus dem Pool aufgebraucht werden und somit nicht mehr für Wachstum zur Verfügung stehen. In diesem Zusammenhang soll die Effektivität verschiedener genetischer Herangehensweisen (einfach oder kombinatorisch) zur Erhöhung des Aminosäure-Bedarfs in der Zelle evaluiert werden (siehe graphischer Abstrakt). Eine dieser Methoden, die enzymatische Umwandlung von Aminosäuren, wird gleichzeitig anstreben wertschöpfende Derivate, die industriell interessant werden können, zu generieren. Der theoretische Teil wird sich auf das Integrieren der experimentell erzeugten Daten der Aminosäure Produktionslast in ein Stoffflussgleichgewicht-Modell (Flux Balance Analysis) konzentrieren, um die Synthesekosten unterschiedlicher Aminosäuren vorhersagen zu können. Diese Informationen können als ein Grundbaustein für die Konstruktion und Optimierung von Prozessen zur heterologen Proteinexpression dienen.

Damalige projektbetreuung: M. Sc. Marleen Beentjes